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Exercice n°13: ETUDE DE LA CROISANCE D'UNE SOUCHE Acetobacter

On étudie la croissance d'une souche d'Acetobacter.

Question 1: Décrire une technique qui permette d'étudier l'évolution de la population bactérienne en fonction du temps.

RéponseNumération en milieu solide par la méthode des dilutions.
1. L'échantillon est dilué de 10 en 10
2. 1mL de chacune des dilutions est incorporé en milieu gélosé solide et soigneusement homogénéisé.
3. Après incubation au temps et à la température convenable on procède au dénombrement, en choisissant de préférence la boîte qui contient entre 30 et 300 colonies.

Dénombrement des bactéries par la méthode des dilutions

Remarque 1: Cette méthode est une technique de dénombrement après culture.
Remarque 2: les chaînettes, les amas ou les agglomérats microbiens ne donnent qu'une seule colonie. C'est poursuoi on doit exprimer les résultats non pas en nombre de cellules mais en unités formant colonies (UFC).

Complément de réponse 1
Autres méthodes de dénombrement après culture

La méthode du nombre le plus probable (NPP): On estime le nombre de microbes viables dans une culture par inoculation de quantités fixes de la suspension initiale et de ses dilutions, en milieu liquide. Le tube qui donnera une culture après incubation contiendra au moins une bactérie viable. En inoculant ainsi 3,5 ou même 10 tubes par dilution, on augmente la précision des résultats qui sont fournis par des tables statistiques (tables de Mac Crady). Le nombre de cultures positives considérées dans 3 dilutions successives donne le nombre le plus probable (NPP) de micro-organismes viables présents dans la culture initiale. La précision obtenue dans ces conditions est nettement inférieure à la précédente.

La méthode par filtration sur membrane: Méthode classique pour la colimétrie dans les eaux. Elle consiste à filtrer un volume déterminé d'une suspension sur une membrane filtrante en cellulose qui est ensuite déposée sur un milieu convenable. Elle a l'avantage de concentrer les bactéries présentes en faibles quantité dans un milieu. Dans les conditions habituelles (étude de la croissance), elle introduit nécessairement une cause d'erreur par défaut.

Les micro-colonies: Pour rendre plus rapide l'analyse et dénombrer les cellules viables sans attendre qu'elles forment de véritables colonies visibles, il est possible selon la technique de Postgate, d'incorporer la suspension bactérienne sur une très mince couche de gélose, coulée sur une lame de verre, puis recouverte d'une lamelle transparente. Après quelques heures d'incubation seulement, les cellules viables donneront naissance à des micro-colonies faciles à observer en microscopie à contraste de phase. Les cellules mortes resteront isolées. Une autre variante est la technique de la lame immergée utilisé surtout lors du dénombrement des germes urinaires.
Complément de réponse 2
Mesure du nombre de cellules

Lecture au microscope: Méthode pratiquée courrammant pour les microbes de grande taille (plusieurs µm) comme les levures. On utilise un hématimètre (cellule de Thoma, de Malassez)

Compteur de particules Cet appareil réalise automatiquement le dénombrement des particules ou des cellules en suspension dans une solution d'électrolytes.

Epifluorescence Les bactéries sont colorées par un fluorochrome comme l'orange d'acridine, puis examinées en lumière UV. On peut théoriquement compter sélectivement les bactéries vivantes qui fluorescent dans le vert (ADN double brin apparié) et les bactéries mortes dont la fluorescence rouge résulte de la combinaison du fluorochrome avec l'ADN dénaturé.
Mesure de la biomasse

Détermination du poids sec: Mesure de base, elle permet la détermination de paramètres spécifiques (vitesse de croissance, taux de production de métabolites). Les micro-organismes sont récoltés par centrifugation ou par filtration sur membrane. Après un lavage soigneux à l'aide d'un tampon approprié (solution saline à 0,9% de NaCl), le culot ou le filtre est desséché à 100-110°C. Après refroidissement à température ambiante en atmosphère sèche ils sont ensuite pesés. Le poids est exprimé généralement en grammes de matière sèche par litre. La mesure du poids sec totalise toute la masse cellulaire vivante et morte. Malgré la simplicité apparente, la technique est délicate à mettre en oeuvre car les opérations de lavage et de dessication notamment, peuvent conduire à des pertes de 5-10% de matière cellulaire; de plus un étalonnage est indispensable pour chaque espèce dénombrée.

Mesure du trouble C'est le procédé le plus simple, le plus rapide et actuellement le plus utilisé pour évalué la masse microbienne. Il s'agit d'une méthode optique générale, appelée turbidimétrie, fondée sur la propriété que présente toute solution d'absorber une partie de l'intensité d'un faisceau de lumière qui la traverse en ligne droite. Elle mesure le % de lumière absorbée (concentration ou épaisseur du milieu trouble) par rapport à l'intensité du faisceau de lumière incidente I0. Par définition log (I0/I représente l'absorbance (A). Si on néglige l'intensité de lumière réfléchie et diffusée:
log (I0/I) = k.C.l
k = coefficient d'absorption
C = la concentration de cellules (biomasse)
l = le trajet optique (épaisseur de la cuve en général = 1cM)
log (I0/I) = k.C
L'absorbance est proporionnelle à la concentration cellulaire. Il est cependant une limite à cette linéarité aux fortes concentrations. Elle varie avec les micro-organismes et une droite de corrélation avec la matière sèche doit être établie dans chaque cas (en général cette limite se situe aux environ de 0,8 unités d'absorbance à 650 nm). Les mesures sont effectuées à l'aide d'un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 650 nm pour laquelle l'absorption de la lumière par les constituants cellulaire est la plus faible. Il existe aujourd'hui des biophotomètres automatiques qui permettent de suivre les cinétiques en continu.
Très séduisante, cette technique est inapplicable avec avec les milieux de culture très colorés ou troubles. Elle est également incapable de différencier les cellules mortes des cellules vivantes et de mesurer des concentrations microbiennes inférieures à 106/mL.

Question 2: Commenter et interpréter cette courbe.

t (heures)        N        t (heures)        N        t (heures)        N        t (heures)        N       
0 105 5 2,51.105 10 1,51.107 15 5,01.107
1 105 6 5,75.105 11 2,51.107 16 5,25.107
2 105 7 1,32.106 12 3,63.107 17 5,25.107
3 105 8 3,02.106 13 4,17.107
4 1,38.105 9 6,92.106 14 4,57.107

2.1. Tracer la courbe LnN = f(t) en justifiant le choix de l'ordonnée LnN plutôt que N (échelle 1,5 cM = 1h en abscisse).

RéponseLe choix de LnN au lieu de N: Il s'impose dans la mesure où l'on désire linéariser en courbe la phase exponentielle, afin de l'interpréter et d'en tirer les paramètres caractérisant la croissance (taux de croissance et temps de génération).


Valeurs de LnN:

t LnN t LnN t LnN t LnN
0 11,5 5 12,45 10 16,55 15 17,7
1 11,5 6 13,25 11 17,05 16 17,75
2 11,5 7 14,1 12 17,4 17 17,75
3 11,5 8 14,9 13 17,55
4 11,85 9 15,75 14 17,65

2.2. Indiquer sur cette courbe les différentes phases de la croissance.

Réponse
1. Phase de latence: de 0 - 3h


2. Phase d'accélération: de 3 - 4h


3. Phase exponentielle: de 4 - 10h


4. Phase de décélération: de 10 - 16h


5. Phase stationnaire après 16h

2.3. Ecrire la relation existant entre LnNt (logarithme de N au temps t) et LnNt+G (logarithme de N au temps t + G), G étant le temps de génération, t et t + G étant pris en phase exponentielle de croissance.

Réponse
Ln (Nt+G) = LnNt + Ln2
car G étant le temps de doublement de population:
Nt+G = 2Nt et Ln2Nt = LnNt + Ln2.

2.4. Déterminer directement sur la courbe tracée le temps de génération (on prendra Ln2 = 0,7).

Réponse
Soit LnNt = 12,45 à t = 5h
Et Ln2Nt = 12,45 + Ln2
Soit 12,45 + 0,7 = 13,15 d'abscisse temps 5h50 environ.
Le temps de génération, G, est donc de 50 min

2.5. Calculer le taux de croissance µx expo.

Réponse
Soit LnN1 = 12,45 à t1 = 5h et LnN2 = 16,55 à t2 = 10h
Tous 2 pris en phase exponentielle
Le taux de croissance, µx expo, s'exprime par la relation (LnN2 - LnN1) / (t2 - t1)
Soit (16,55 - 12,45) / (10 - 5) = 0,82 h-1

2.6. Vérifier la concordance des réponses aux questions 2.4 et 2.5..

Réponse
Ce taux de croissance est relié au temps de génération par la relation G = Ln2 / µx expo
Si l'on calcule on trouve 0,7 / 0,82 = 0,85 heures
Soit G = 50 min
Ce qui confirme ce que l'on a trouvé graphiquement au 2.4.